Мультифотонна мікроскопія: застосування у дерматологічній практиці

Інна Крулько , кандидат біологічних наук, вірусолог, мікробіолог (Україна)

Сьогодні головним завданням, рішення якого покликана забезпечити мікроскопічна техніка, є глибше проникнення в зразок, щоб забезпечити найкращі можливості для вивчення клітин, органів та тканин. Один з найефективніших способів добитися глибокого проникнення в препарат – це використання двофотонного та мультифотонного збудження в лазерних мікроскопах, що сканують, які оснащені пульсуючими інфрачервоними лазерами. Завдяки зменшеному поглинанню та розсіюванню збудливого світла дво- та мультифотонні конфокальні мікроскопи дозволяють досягти глибини проникнення близько 400 мкм.

Структура шкіри

Шкіра, з її поверхнею площею 1,5–2 м2, є найбільшим органом людського тіла.

Зовнішній шар шкіри, епідерміс, утворений епітеліальними клітинами, що лежать один над одним у кілька десятків шарів. Верхня частина епідермісу контактує безпосередньо із зовнішнім середовищем і називається роговим шаром - він складається з старих і ороговілих клітин, які постійно злущуються з поверхні шкіри і замінюються молодими, які мігрують з глибоких шарів епідермісу.

За роговим шаром слідує кілька шарів живих кератиноцитів. Кератиноцити мають різну будову у різних шарах епідермісу. Зокрема базальні кератиноцити – овальні. За розміром вони менші, ніж шипуваті клітини. У ділянках з потовщеним епідермісом клітини базального шару витягнуті у вертикальному напрямку. Їхня плазмалема (плазматична мембрана) характеризується рівними контурами і має товщину 7–8 нм.

У найглибшому шарі епідермісу розташовані меланоцити – клітини, які виробляють пігмент меланін. Меланін – це неоднорідна хімічна сполука, яка поділяється на два види: еумеланін та феомеланін, кожен з яких має різні спектральні властивості.

Дерма також неоднорідна. У ній є багато важливих функціональних елементів, у тому числі волосяні фолікули, потові, сальні та апокринні залози, нервові волокна та їх рецептори, кровоносні та лімфатичні судини. Структура волосяного фолікула особливо важлива, оскільки недавні дослідження показали, що в нішах волосяних фолікулів знаходяться стовбурові клітини шкіри, необхідні для її репарації після травм.

Мультифотонна мікроскопія

Мультифотонна мікроскопія (англ. – multiphoton microscopy, далі МФМ. – Прим. ред.) – похідна від лазерної скануючої конфокальної мікроскопії методика, при якій збудження флуорохромів здійснюється лазерним випромінюванням інфрачервоного або довгохвильового видимого діапазону, щільність якого подвоюється або навіть зразок. Флуорофори зразка перетворюються на збуджений стан двома або трьома довгохвильовими фотонами, що еквівалентно збудженню одним короткохвильовим фотоном. Наприклад, збудження двома або трьома фотонами з довжиною хвилі 900 нм еквівалентно збудженню одним фотоном з довжиною хвилі 450 або 300 нм. Мультифотонна мікроскопія забезпечує більш глибоке проникнення в товщу тканин і не потребує наявності конфокальної мікродіафрагми, оскільки її флуоресценція виникає строго у фокальній площині.

Винахід у 90-ті роки мультифотонної мікроскопії викликав величезний інтерес. На даний час ця техніка стала широко поширеною в біології та медицині. З'явилося безліч методів, підходів та публікацій, у яких використовується мультифотонна мікроскопія.

Зараз це основний метод для неушкоджуючої флуоресцентної мікроскопії глибокого проникнення при використанні товстих зразків, що розсіюють світло. Він використовується для різних препаратів: лімфатичних органів, нирок, серця, шкіри і мозку (зрізів або інтактних органів). Переваги глибокого проникнення та мультифотонної in vivo реєстрації зображень у товщі препарату використовуються в різних галузях біомедичних досліджень, наприклад, в імунології (відстеження лімфоцитів), ембріології, онкології та особливо в нейробіології (у тому числі для вивчення динаміки кальцію та нейрональної пластичності).

Дослідження шкіри за допомогою МФМ

За допомогою МФМ може бути ефективно вивчена структура та біохімія шкіри із застосуванням контрастних агентів, таких як органічні флуорофори або синтезовані флуоресцентні білки. Більшість відбитого шкірою світла утворюється з допомогою зворотного розсіювання різними шарами.

Вклад різних шарів шкіри в процеси поглинання та розсіювання світла різний. Основними компонентами, що визначають поглинаючі та розсіюючі властивості шкіри, є пігментований епідерміс (меланін), дерма та кровоносні судини дерми (гемоглобін).

• Роговий шар відбиває близько 5-7% падаючого випромінювання.
• Шар епідермісу дифузно розсіює падаюче випромінювання, роблячи внесок у коефіцієнт відбиття шкіри у видимій області спектра.
• Випромінювання, що пройшло епідермальний шар, сильно поглинається меланіном, що міститься в ньому, практично у всьому видимому спектральному діапазоні, причому коефіцієнт поглинання зростає при зміщенні в короткохвильову область спектру.
• Світло, що пройшло через шар дерми, пронизаної кровоносними судинами, частково поглинається гемоглобіном.
• Нарешті, непоглинена частина випромінювання, що залишилася, дифузно відбивається від шару, що містить колагенові волокна і, перш ніж вийти назовні, проходить ще раз через шари дерми і епідермісу, що містять гемоглобін і меланін.

Кератиноцити можуть бути візуалізовані за допомогою флуоресценції відновлених піридинових основ або окислених флавінових білків. Важливо, що клітинний метаболізм може підлягати неінвазивному дослідженню за допомогою редокс-флуориметрії.

Колаген та еластин дерми також вивчають на основі їхньої флуоресценції. Декілька ізоформ колагену, у тому числі I типу, часто викликають більш високу генерацію другої гармоніки сигналу через їх асиметричну молекулярну структуру та кристалічну організацію. Такий феномен може надати інформацію про сприйнятливість позаклітинного матриксу, а також докладніші дані про організацію молекул колагенових волокон.

МФМ та меланома

У зв'язку із зростанням у світі кількості меланом вчені почали детально вивчати структуру меланіну за допомогою візуалізації МФМ. Так, останні дослідження показали суттєву різницю між еумеланіном та феомеланіном. На моделі мишей було показано, що меланома частіше розвивалася з «невидимих» невусів, що містять еумеланін, ніж із темних з великою кількістю феомеланіну. Дослідження іn vivo біопсійного матеріалу базальноклітинної меланоми людини показали посилену флуоресценцію ракової тканини. Крім того, спостерігалися морфологічні зміни в меланоцитах: клітини були більш подовженими, ніж здорові, і мігрували лише конгломератами. Більше того, метод дозволяє відрізнити впорядкований колаген, більш характерний для здорової шкіри, від невпорядкованого колагену пухлинної тканини. Вивчення шкіри за допомогою МФМ може надалі відігравати важливу роль у ранній діагностиці онкологічних захворювань шкіри.

МФМ та хронічні дерматози

Шкіра хворих на хронічні дерматози, вільна від висипань, має структурні та функціональні відмінності від здорової шкіри, особливо у пацієнтів, які страждають на атопічний дерматит. УФО та ПУВА-терапія змінюють параметри зображення та функціональні параметри вогнищ псоріазу та атопічного дерматиту, а також шкіри, вільної від висипань, що дозволяє рекомендувати неінвазивні методи дослідження морфофункціонального стану шкіри, зокрема МФМ.

Вивчення деформації шкіри у відповідь на зовнішній механічний вплив використовується при оцінці старіння шкіри, ураженнях сполучної тканини при склеродермії, синдромі Елерса – Данлоса, псоріазі, дослідженні атрофії та набряку шкіри внаслідок ультрафіолетового опромінення. Також за допомогою МФМ вивчався процес лазерного лікування зморшок після термального шоку фібробластів, які починають виробляти більше колагену.

МФМ та ефективність косметики

Важливо відзначити роль МФМ щодо дії косметичних продуктів. Дуже часто спостерігається нестача даних щодо їх ефективності та безпеки. Поява МФМ, яка дозволяє в природних умовах провести дослідження багатьох з цих продуктів на тваринних моделях та людях-добровольцях, дозволить детальніше вивчити вплив косметичного препарату на шкіру та організм, більш точно провести токсикологічні дослідження.

Варіації на тему

Існують також методики скануючої МФМ, за допомогою яких можна вивчати динаміку процесів у шкірі.

• Так, використовуючи FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), можна локально вимірювати безліч різних параметрів усередині клітин або інших структур, наприклад, концентрацію іонів, взаємодію молекул, мембранний потенціал. Таким чином, дослідник отримує інформацію про процеси, що протікають на молекулярному рівні.
• FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) – це метод кількісного вимірювання концентрації та швидкості дифузії на рівні окремих молекул. Отримані цим методом дані дозволяють аналізувати міжмолекулярні взаємодії та процеси транспортування як усередині живих клітин, так і in vitro. Це дає можливість вивчати динаміку молекулярних систем та клітинних структур.

Незважаючи на очевидні переваги МФМ, існують деякі ліміти та складності у застосуванні даного методу. Висока вартість обладнання, безумовно, накладає основні обмеження широкого використання методу клініцистами. В даний час робляться спроби розробки менш витратних і компактніших скануючих технологій, що, можливо, зробить даний метод обстеження доступним. Потрібен також час і значні зусилля щодо створення навчальних програм для навчання фахівців інтерпретації отриманих зображень, їх трактування з метою отримання корисної клінічної та гістологічної інформації.

У цілому нині розвиток і впровадження у практику неінвазивних методів діагностики нині є актуальним всім областей медицини, зокрема дерматології, що, передусім, пов'язані з пріоритетом безпеки досліджень пацієнта. Розвиток сучасних методик діагностики закладено у програму модернізації охорони здоров'я, яка передбачає оперативне впровадження наукових розробок у практичну охорону здоров'я. Одним із найбільш інформативних методів, що наближаються за інформативністю до традиційної біопсії, є мультифотонна мікроскопія шкіри, яка дозволяє пошарово оцінювати структуру шкіри без її ушкодження.

Вперше опубліковано: Les Nouvelles Esthetiques Україна, №6 (88), 2014