Мультифотонная микроскопия: применение в дерматологической практике

Инна Крулько, кандидат биологических наук, вирусолог, микробиолог (Украина)

---

Сегодня главной задачей, решение которой призвана обеспечить микроскопическая техника, является более глубокое проникновение в образец, чтобы обеспечить лучшие возможности для изучения клеток, органов и тканей. Один из самых эффективных способов добиться глубокого проникновения в препарат – это использование двуфотонного и мультифотонного возбуждения в лазерных сканирующих микроскопах, которые оснащены пульсирующими инфракрасными лазерами. Благодаря уменьшенному поглощению и рассеиванию возбуждающего света дву- и мультифотонные конфокальные микроскопы позволяют достичь глубины проникновения около 400 мкм.

Структура кожи

Кожа, с ее поверхностью площадью 1,5–2 м2, представляет собой самый большой орган человеческого тела.

Наружный слой кожи, эпидермис, образован эпителиальными клетками, лежащими друг над другом в несколько десятков слоев. Верхняя часть эпидермиса контактирует непосредственно с внешней средой и называется роговым слоем – он состоит из состарившихся и ороговевших клеток, которые постоянно слущиваются с поверхности кожи и заменяются молодыми, мигрирующими из глубоких слоев эпидермиса.

За роговым слоем следует несколько слоев живых кератиноцитов. Кератиноциты имеют различное строение в различных слоях эпидермиса. В частности, базальные кератиноциты – овальные. По размеру они меньше, чем шиповатые клетки. В участках с утолщенным эпидермисом клетки базального слоя вытянуты в вертикальном направлении. Их плазмалемма (плазматическая мембрана) характеризуется ровными контурами и имеет толщину 7–8 нм.

В самом глубоком слое эпидермиса расположены меланоциты – клетки, вырабатывающие пигмент меланин. Меланин – это неоднородное химическое соединение, которое разделяется на два вида: эумеланин и феомеланин, каждый из которых имеет различные спектральные свойства.

Дерма также неоднородна. В ней присутствует много важных функциональных элементов, в том числе волосяные фолликулы, потовые, сальные и апокринные железы, нервные волокна и их рецепторы, кровеносные и лимфатические сосуды. Структура волосяного фолликула особенно важна, поскольку недавние исследования показали, что в нишах волосяных фолликулов находятся стволовые клетки кожи, необходимые для ее репарации после травм.

Мультифотонная микроскопия

Мультифотонная микроскопия (англ. – multiphoton microscopy, далее МФМ. – Прим. ред.) – производная от лазерной сканирующей конфокальной микроскопии методика, при которой возбуждение флуорохромов осуществляется лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона, плотность которого удваивается или даже утраивается в месте фокусировки на образце. Флуорофоры образца переводятся в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами, что эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Например, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм. Мультифотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в толщу тканей и не требует наличия конфокальной микродиафрагмы, так как ее флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости.

Изобретение в 90-е годы мультифотонной микроскопии вызвало огромный интерес. К настоящему времени эта техника стала широко распространенной в биологии и медицине. Появилось огромное количество методов, подходов и публикаций, в которых используется мультифотонная микроскопия.

Сейчас это основной метод для неповреждающей флуоресцентной микроскопии глубокого проникновения при использовании толстых, рассеивающих свет образцов. Он используется для самых разных препаратов: лимфатических органов, почек, сердца, кожи и мозга (срезов или интактных органов). Преимущества глубокого проникновения и мультифотонной in vivo регистрации изображений в толще препарата используются в различных областях биомедицинских исследований, например в иммунологии (отслеживание лимфоцитов), эмбриологии, онкологии и особенно в нейробиологии (в том числе для изучения динамики кальция и нейрональной пластичности).

Исследования кожи с помощью МФМ

С помощью МФМ может быть эффективно изучена структура и биохимия кожи с применением контрастных агентов, таких как органические флуорофоры или синтезируемые флуоресцирующие белки. Большая часть отраженного кожей света образуется за счет обратного рассеивания различными слоями.

Вклад различных слоев кожи в процессы поглощения и рассеивания света различен. Основными компонентами, определяющими поглощающие и рассеивающие свойства кожи, являются пигментированный эпидермис (меланин), дерма и кровеносные сосуды дермы (гемоглобин).

• Роговой слой отражает около 5–7% падающего излучения.
• Слой эпидермиса диффузно рассеивает падающее излучение, делая вклад в коэффициент отражения кожи в видимой области спектра.
• Излучение, прошедшее эпидермальный слой, сильно поглощается содержащимся в нем меланином практически во всем видимом спектральном диапазоне, причем коэффициент поглощения возрастает при смещении в коротковолновую область спектра.
• Свет, прошедший через слой дермы, пронизанной кровеносными сосудами, частично поглощается гемоглобином.
• Наконец, оставшаяся непоглощенная часть излучения диффузно отражается от слоя, содержащего коллагеновые волокна и, прежде чем выйти наружу, проходит еще раз через слои дермы и эпидермиса, содержащие гемоглобин и меланин.

Кератиноциты могут быть визуализированы с помощью флуоресценции восстановленных пиридиновых оснований или окисленных флавиновых белков. Важно отметить, что клеточный метаболизм может подлежать неинвазивному исследованию при помощи редокс-флуориметрии.

Коллаген и эластин дермы также изучают на основе их флуоресценции. Несколько изоформ коллагена, в том числе I типа, часто вызывают более высокую генерацию второй гармоники сигнала из-за их асимметричной молекулярной структуры и кристаллической организации. Такой феномен может предоставить информацию о восприимчивости внеклеточного матрикса, а также более подробные данные об организации молекул коллагеновых волокон.

МФМ и меланома

В связи с возрастанием в мире количества меланом ученые начали детально изучать структуру меланина с помощью визуализации МФМ. Так, последние исследования показали существенную разницу между эумеланином и феомеланином. На модели мышей было показано, что меланома чаще развивалась из «невидимых» невусов, содержащих эумеланин, нежели из темных с большим количеством феомеланина. Исследования іn vivo биопсийного материала базальноклеточной меланомы человека показали усиленную флуоресценцию раковой ткани. Кроме того, наблюдались морфологические изменения в меланоцитах: клетки были более удлиненными, чем здоровые, и мигрировали только конгломератами. Более этого, метод позволяет отличить упорядоченный коллаген, более характерный для здоровой кожи, от неупорядоченного коллагена опухолевой ткани. Изучение кожи с помощью МФМ может в дальнейшем играть важную роль в ранней диагностике онкологических заболеваний кожи.

МФМ и хронические дерматозы

Кожа больных хроническими дерматозами, свободная от высыпаний, имеет структурные и функциональные отличия от здоровой кожи, особенно у пациентов, страдающих атопическим дерматитом. УФО и ПУВА-терапия изменяют параметры изображения и функциональные параметры очагов псориаза и атопического дерматита, а также кожи, свободной от высыпаний, что позволяет рекомендовать неинвазивные методы исследования морфофункционального состояния кожи, в частности МФМ.

Изучение деформации кожи в ответ на внешнее механическое воздействие используется при оценке старения кожи, поражениях соединительной ткани при склеродермии, синдроме Элерса – Данлоса, псориазе, исследовании атрофии и отека кожи вследствие ультрафиолетового облучения. Также с помощью МФМ изучался процесс лазерного лечения морщин после термального «шока» фибробластов, которые начинают вырабатывать больше коллагена.

МФМ и эффективность косметики

Важно отметить роль МФМ при исследовании действия косметических продуктов. Очень часто наблюдается недостаток данных по их эффективности и безопасности. Появление МФМ, которая позволяет в естественных условиях провести исследования многих из этих продуктов на животных моделях и людях-добровольцах, позволит более детально изучить влияние косметического препарата на кожу и организм, более точно провести токсикологические исследования.

Вариации на тему

Существуют также методики сканирующей МФМ, с помощью которых можно изучать динамику процессов в коже.

• Так, используя FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), можно локально измерять множество различных параметров внутри клеток или иных структур, например концентрацию ионов, взаимодействие молекул, мембранный потенциал. Таким образом, исследователь получает информацию о протекающих процессах на молекулярном уровне.
• FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) – это метод количественного измерения концентрации и скорости диффузии на уровне отдельных молекул. Полученные этим методом данные позволяют анализировать межмолекулярные взаимодействия и процессы транспортировки как внутри живых клеток, так и in vitro. Это дает возможность изучать динамику молекулярных систем и клеточных структур.

Несмотря на очевидные достоинства МФМ, существуют некоторые лимиты и сложности в применении данного метода. Высокая стоимость оборудования, безусловно, накладывает основные ограничения на широкое использование метода клиницистами. В настоящее время делаются попытки разработки менее затратных и более компактных сканирующих технологий, что, возможно, сделает данный метод обследования доступным. Необходимы также время и значительные усилия по созданию учебных программ для обучения специалистов интерпретации полученных изображений, их трактовки с целью получения полезной клинической и гистологической информации.

В целом развитие и внедрение в практику неинвазивных методов диагностики в настоящее время является актуальным для всех областей медицины, в том числе для дерматологии, что, прежде всего, связано с приоритетом безопасности исследований для пациента. Развитие современных методик диагностики заложено в программу модернизации здравоохранения, предусматривающую оперативное внедрение научных разработок в практическое здравоохранение. Одним из наиболее информативных методов, приближающихся по информативности к традиционной биопсии, является мультифотонная микроскопия кожи, которая позволяет послойно оценивать структуру кожи без ее повреждения.

---

Впервые опубликовано: Les Nouvelles Esthetiques Украина, №6 (88), 2014