Клеточные технологии в лечении витилиго: обзор методик

---

Владимир Цепколенко, д. м. н., заслуженный врач Украины, профессор кафедры дерматовенерологии и косметологии Донецкого национального медицинского университета им. М. Горького, генеральный директор Украинского института пластической хирургии и косметологии «Виртус» (Украина)

Екатерина Карпенко, врач-дерматолог клиники «Виртус» (Украина)

Дмитрий Пыхтеев, заведущий отделением клеточной трансплантации клиники «Виртус», заведующий биотехнологической лабораторией «Смарт Селл» (Украина)

---

Распространенность данного заболевания в мире колеблется в зависимости от региона и составляет от 0,5 до 8,2%. Его характерной чертой являются резко ограниченные депигментированные участки кожи, оказывающие значительное негативное влияние на психоэмоциональное состояние пациента, а следовательно, и на качество его жизни. Именно поэтому сегодня чрезвычайно актуальным является правильный выбор тактики лечения, позволяющей достичь максимально лечебного и эстетического результата.

Введение

Истинная причина деструкции меланоцитов до сих пор не установлена. Однако можно выделить ряд наиболее обоснованных теорий патогенеза витилиго, среди них:

• аутоиммунная;
• нейрогенная;
• биохимическая;
• дисбаланса эпидермальных цитокинов;
• генетическая.

По последним данным, в развитии витилиго велика роль кератиноцитов: они больше подвержены апоптозу, а изменения меланоцитарно-кератиноцитарного состава могут приводить к уменьшению выработки кератиноцитообусловленного фактора роста меланоцитов и, соответственно, гибели меланоцитов.

Традиционная терапия, как правило, заключается в применении местных стероидов, «Псоралена» и УФ (А). Как показывает практика, узкополосный UVB не всегда приводит к удовлетворительному результату: после длительного и последовательного лечения только у половины пациентов удается достичь репигментации кожи в пределах 75% и более.

В отношении устойчивых к традиционным методам и не прогрессирующих форм витилиго до недавнего времени наиболее актуальным было применение методик тканевого графтинга. Сегодня же, с развитием клеточных технологий, появилась возможность применения клеточного графтинга, для которого используются культивированные меланоциты и некультивированные клеточные суспензии меланоцитов и кератиноцитов. На этих методиках и хотелось бы остановиться подробнее.

Лечение витилиго с помощью некультивированных меланоцитов

Метод используется для лечения пациентов с сегментарным и фокальным витилиго. Впервые был применен Gauthier и Surleve-Bazeille в 1992 году введением суспензии клеток, полученной из кожи волосистой части головы, в волдырь, образованный путем замораживания участка кожи витилиго. Однако применимость данной методики была ограниченна в связи с возможностью локального охлаждения только на некоторых участках тела, трудностью дозирования охлаждения, а также опасностью гипопигментации при криоповреждении периферических меланоцитов. В 1997 году Olsen и Juhlin использовали слой базальных клеток, обогащенных эпидермальной клеточной суспензией, и достигали репигментации 85%.

В 2001 году Geel и др. модифицировали две эти методики. При этом суспензия клеток с помощью пипетки распределяется на дермабразированной поверхности пятна витилиго, покрывается стерильной окклюзионной повязкой на одну неделю. Через три недели возможно применение ПУВА или узкополосного UVB. Этот метод требует специального оборудования, хотя по сравнению с культивированием меланоцитов считается сравнительно недорогим и требует меньше времени. Кроме того, у 70% пациентов спустя три месяца была достигнута репигментация порядка 55%.

При добавлении меланоцитарной (М2) среды для культивирования клеточная суспензия обогащается, способствуя восстановлению более крупных дефектов (Olsson и Juhlin, 1998). При добавлении гиалуроновой кислоты в клеточную суспензию увеличивается ее вязкость, что позволяет улучшить прикрепление клеток к реципиентным участкам (van Geel и др, 2001). Было установлено, что минимальное количество меланоцитов, требуемое для достижения достаточной репигментации, варьирует в пределах 210–250⁄мм2 (Tegta и др., 2006).

Исследование S. Mulekar (2004) включало трансплантацию некультивируемой меланоцитарно-кератиноцитарной клеточной суспензии 50 пациентам с сегментарным витилиго и 17 – с фокальным витилиго, с последующим 5-летним периодом наблюдения. Образец кожи был получен в результате shave-биопсии в размере 1⁄10 от реципиентной области. Готовую клеточную суспензию наносили на дермабразированный депигментированный участок кожи и покрывали коллагеновой повязкой.

В группе сегментарного витилиго 41 пациент (84%) показал отличную репигментацию, 3 (6%) – хорошую и 5 пациентов (10%) – плохую репигментацию, которая не была сохранена до конца соответствующего периода наблюдения.

В группе фокального витилиго 11 пациентов (73%) показали отличную репигментацию, 1 (7%) – удовлетворительную, и 3 (20%) – плохую репигментацию, которая не сохранилась до конца периода наблюдения.

В исследовании E. Gan и др. (2011) была проведена трансплантация некультивируемой меланоцитарно-кератиноцитарной клеточной суспензии (клеточный графтинг) 84 пациентам, у 13 из них трансплантация проводилась в участках лейкотрихии. Из ягодичной области под местной анестезией был взят ультратонкий трансплантат кожи размером 1/5 от участка витилиго. Донорскую ткань измельчили и инкубировали в 0,25%-м растворе трипсина 30 минут при температуре 37 °С. Впоследствии донорская ткань эпидермиса была механически отделена от дермы, клеточная суспензия нейтрализована соевым ингибитором трипсина и центрифугирована. Осадок полученных клеток ресуспендировали в 0,5–1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора. После наложения анестезирующего крема под окклюзию на участки витилиго (экспозиция – 1 час) была проведена абляция СО2-лазером. После этого аблированная поверхность была покрыта клеточной суспензией с наложением стерильной коллагеновой повязки и закреплена пластырем на срок до одной недели.

У 12 пациентов (92%) наблюдалась плохая репигментация лейкотрихии через три месяца после трансплантации. Через шесть месяцев удовлетворительная репигментация была достигнута у восьми пациентов (67%). Спустя 9–12 месяцев наблюдения у 91% пациентов (10 из оставшихся 11) была достигнута репигментация, качество которой оценивалось от «хорошо» до «отлично».

Таким образом, при помощи некультивируемого клеточного графтинга может быть достигнута репигметация при лейкотрихии (от хорошей до отличной), что устраняет необходимость трансплантации волос. Эта работа представляет особый интерес ввиду трудности достижения репигментации у пациентов с витилиго на участках лейкотрихии, что связано со скудным количеством меланоцитов вне устьев волосяных фолликулов.

Механизм репигментации лейкотрихии при некультивируемом клеточном графтинге изучен пока недостаточно, однако предположительно может быть связан с ретроградной миграцией пересаженных меланоцитов или эпидермальных стволовых клеток в волосяные фолликулы и /или продукцией ими цитокинов, которые стимулируют меланогенез волосяного фолликула. Этот механизм может объяснять более длительное время, необходимое на репигментацию участка лейкотрихии, по сравнению с эпидермальной репигментацией.

Лечение витилиго с помощью культивированных меланоцитов

Данная методика была описана Lerner и др. (1987), которые добились успешной репигментации путем введения культивированных меланоцитов пациентам с пиебалдизмом. В дальнейшем были опубликованы и другие подходы к трансплантации меланоцитов в различных условиях культивирования, в том числе и при использовании гиалуроновых матриц. В нескольких работах была показана успешность применения искусственной гиалуроновой матрицы для роста кератиноцитов и меланоцитов.

Культивированные меланоциты могут быть внесены в виде чистой клеточной суспензии или сокультивироваться с кератиноцитами. Последний вариант, возможно, является более подходящим в связи с тем, что кератиноциты регулируют рост и дифференциацию меланоцитов, выделяя большое количество цитокинов. Меланоциты сохраняют свои физиологические особенности при их совместном культивировании с кератиноцитами, которые также могут быть произведены в большом количестве.

Трансплантация смешанной культуры клеток используется на протяжении 20 лет. При этом достоверной корреляции проводимой терапии с увеличением риска возникновения карциномы или меланомы кожи выявлено не было. Донорский участок может быть получен путем биопсии или образования пузыря. Реципиентный участок может быть подготовлен дермабразией, Er: YAG- или CO2-лазером.

В исследовании, проводимом авторами статьи, принимали участие 32 пациента, больных витилиго, которым была назначена терапия культивируемыми меланоцитами. В результате проведенного лечения репигментация конечностей и периоральных участков составила 8%, а на других участках – 88–96% (Guerra и др., 2000); в другом исследовании 18 из 21 пациентов получили 90% репигментации (Guerra и др., 2003).

В исследовании Chen и др. (2004) при пересадке культивированных меланоцитов у 84% из 120 пациентов с устойчивым локализованным витилиго получили от 90 до 100% репигментации, среди пациентов с устойчивым генерализованным витилиго процент полной репигментации составил 54%, и лишь у 14% пациентов с активным генерализованным витилиго наблюдалась значительная репигментация.

В исследовании Kyoichi Matsuzaki и Norio Kumagai (2013) была проведена трансплантация культивированных меланоцитов 27 пациентам со стабильным витилиго, устойчивым к традиционной терапии. В исследовании участвовало 20 пациентов с сегментарным витилиго и семь пациентов с генерализованным витилиго, контроль проводился на протяжении года после трансплантации.

Кератиноциты были получены из первичной культуры или из первого пассажа. Перед трансплантацией область витилиго была деэпителизирована абразивным способом, после – нанесены культивированные клетки и накрыты влажной повязкой. После полной эпителизации реципиентный участок подвергали УФ-облучению.

В группе с сегментарным витилиго у 12 из 20 пациентов наблюдался хороший терапевтический эффект (90% и более репигментации) уже после первой пересадки, а после повторной их число увеличилось до 14. У остальных шести пациентов были получены удовлетворительные результаты (50–90% репигментации). У пациентов с генерализованным витилиго хороших результатов достигнуто не было, несмотря на неоднократное использование хирургических методов (три пациента – удовлетворительные результаты, четыре – без изменений).

Использование различных биотехнологических приемов позволяет проводить очень гибкую терапию рассматриваемого заболевания. Особенный интерес представляют методы криоконсервирования полученных клеточных суспензий.

Меланоцитарные суспензии, сохранявшиеся в замороженном состоянии на протяжении 6–12 месяцев, были повторно культивированы после разморозки и пересажены четырем пациентам; наступившая успешная репигментация очагов витилиго позволяет сделать вывод о большом потенциале криоконсервированных клеток для успешного лечения витилиго (Olsson и др., 1994).

Метод культивирования меланоцитов требует специализированного оборудования, создания аутологических дорогостоящих культур, наличия высококвалифицированных специалистов, а также занимает значительное время.

Биологический процесс культивирования кератиноцито-меланоцитарной смеси состоит из забора участка кожи (если это необходимо, то предварительно индуцированной пигментации). Затем биоптаты направляются в биотехнологическую лабораторию. Там они проходят ферментативную обработку и отделение дермы от эпидермиса. Эпидермальный слой используют в работе после выделения кератиноцитарно-меланоцитарной суспензии, которая обычно культивируется на среде DMEM, иногда на смеси сред DMEM-F 12, в разных соотношениях.

Существенным преимуществом этого метода является возможность лечения больших участков витилиго с помощью небольшого донорского участка. Также трансплантация культивированных кератиноцитов оказалась более эффективной при лечении сегментарного витилиго, а не генерализованного.

В настоящее время метод культивирования меланоцитов успешно используется в терапии устойчивых форм витилиго в ИПХ «Виртус» (Одесса). Во многом это стало возможно благодаря тесному сотрудничеству с единственной на юге Украины биотехнологической лабораторией, оснащенной в соответствии со стандартами GMP. Высококвалифицированные специалисты биотехнологической лаборатории тщательно контролируют каждый этап подготовки клеточного материала и гарантируют его качество и безопасность.

Общие принципы терапии витилиго с использованием клеточных технологий

Выбор метода. Любая правильно выполненная техника из приведенных выше ведет к положительным результатам. Важным принципом является использование наименее инвазивного метода с целью получения лучших результатов, также важно сохранить целостность донорских участков.

Отбор пациентов. При проведении репигментации кожи с помощью клеточных технологий следует принимать во внимание ряд факторов, таких как:

• устойчивая форма витилиго: степень устойчивости витилиго не имеет специального определения, однако чем дольше период наблюдения, тем более устойчивым считается форма заболевания. Сегментарное (одностороннее) витилиго является наиболее устойчивой формой, которая хорошо реагирует на клеточную терапию;
• соответствие результатов ожиданиям пациентов: внешний вид кожи после репигментации не всегда совпадает с видом здоровой кожи, кроме того, результаты отличаются у разных пациентов. Возможна небольшая гиперпигментация, однако степень ее незначительна по сравнению с полученными положительными изменениями;
• степень депигментации: наилучшие результаты наблюдаются у пациентов ІІІ–VI фототипов по Фитцпатрику на полностью депигментированных участках, гипопигментированные участки репигментируются значительно хуже;
• локализация витилиго на открытых участках: в терапии витилиго с такой локализацией заинтересованы большинство пациентов. Хотя тыльная поверхность кистей и пальцев – наиболее трудно поддающиеся участки, однако при четко определяемой устойчивой форме возможно добиться успешной репигментации и на этих участках;
• этапность лечения: в ряде случаев для достижения наилучшего результата может быть произведено повторное введение клеточной взвеси, но не ранее чем через три месяца после первого введения;
• психологические аспекты: некоторые пациенты предъявляют повышенные требования в отношении минимальной или умеренной депигментации, пациенты должны быть внимательно обследованы для определения реальной необходимости хирургического лечения;
• фоторегистрация: фотодокументация всегда рекомендуется для оценки качества и процентной величины репигментации, а также возможных побочных эффектов;
• выбор метода и донорские участки: рекомендуется использовать минимально неинвазивные методы. Донорские участки должны быть максимально закрыты, возможно использование зоны ягодиц, внутренней верхней части бедра или предплечья.

Противопоказания. Пациенты с гипертрофическими и келоидными рубцами, гиперпигментацией на местах ожогов или травм должны быть внимательно обследованы во избежание подобных осложнений при проведении лечения с применением клеточных технологий.

Побочные эффекты:

• инфицирование: встречается редко, однако необходимо помнить о соблюдении правил асептики и антисептики для профилактики бактериальных инфекций; при обострении герпетической инфекции применяются антивирусные препараты системно;
• поствоспалительная гиперпигментация: в основном носит временный характер у большинства пациентов, особенно у людей с кожными фототипами от IV до VI. Противовоспалительные цитокины, активированные в процессе хирургических манипуляций, могут играть важную роль в патогенезе гиперпигментации. Постоянная гиперпигментация на травмированных участках кожи может являться противопоказанием для клеточной терапии.

Выводы

Применение клеточных технологий в дерматологии открыло новые возможности в поиске эффективных методик лечения витилиго. На сегодняшний день многие пациенты получают традиционную терапию витилиго, тем не менее частичная или неполная репигментация встречается у достаточно большого числа пациентов. Различные виды терапии успешно используются для лечения витилиго в области лица и шеи, на туловище и проксимальных частях конечностей – с удовлетворительными результатами, на акральных частях конечностей эффект слабый или вообще отсутствует.

При обширном генерализованном двустороннем витилиго наилучшие результаты достигаются при терапии NB UVB и PUVA, тогда как в случае локализованного витилиго наибольшую эффективность показывают топические кортикостироиды и ингибиторы кальциневрина.

Современный комплексный подход к лечению устойчивых форм витилиго, применяемый в ИПХ «Виртус», включает комбинацию узкополосной фототерапии с максимумом эмиссии на 311 нм, введение культивированной меланоцитарно-кератиноцитарной взвеси, а также наружную терапию (ингибиторы кальционеврина, эмоленты и др.) и лечение сопутствующих заболеваний.

При терапии сегментарного витилиго с применением клеточных методов у 60–100% пациентов уровень репигментации составляет 70–100%, а при терапии стойкого генерализованного витилиго подобный процент репигментации наблюдается только у 50% пациентов. Прогресс дальнейших исследований новых и эффективных методов терапии основан на изучении патогенеза витилиго. Важное значение для определения наиболее эффективной терапии витилиго имеет стандартизация методов оценки как в отношении эффективности, так и качества жизни пациента.

Впервые опубликовано: Les Nouvelles Esthetiques Украина, №5 (87), 2014