Флуоресцентные белки: зачем светят молекулы

Принцип действия

Каждый житель мегаполиса прекрасно знает, как пользоваться бесконтактными банковскими картами или картами для оплаты проезда и аналогичными пропусками в школу или на работу. Проще некуда: поднес карточку к турникету, загорелся зеленый огонек – проходи.

Принцип действия такого устройства понятен даже школьнику: в «голове» турникета находится передатчик, а в карточке – маленькое принимающее устройство. Если это устройство поднести к передатчику турникета на определенное расстояние (в случае с метрополитеном это несколько сантиметров), оно принимает излучение передатчика. В их контуре взаимодействия возникает электрический ток, и простенькая электроника обоих устройств начинает выполнять свою работу – сверяет месяц и число, количество поездок. То же происходит и с банковской картой, поднесенной к считывающему устройству, только массив данных несколько увеличивается. То есть билет или карта получает энергию от считывающего устройства, а потом ее же и испускает, причем энергия билета или карты по закону сохранения энергии всегда будет меньше той, которая досталась им от считывающего устройства, ведь часть ее ушла на обработку информации и одновременно нагрела свое окружение (в прямом смысле). Понятно, что это взаимодействие происходит только в том случае, если передатчик и приемник находятся на определенном, достаточно близком расстоянии.

Но нас с вами должен волновать другой вопрос: насколько маленькими можно создать эти два устройства? Сегодня ответ таков: размером с молекулу и даже меньше, но в этом случае молекулы-передатчики и считывающие устройства должны быть флуорофорами: одна должна уметь испускать свет (донор), а вторая – поглощать его (акцептор). Причем такой перенос энергии возможен не для любых, а для строго определенных пар доноров и акцепторов (вы же не пройдете в метро по своему рабочему пропуску).

Понятно, что в случае очень маленьких передатчиков взаимодействие между ними происходит на расстояниях, равных межмолекулярному взаимодействию – нескольким десяткам ангстрем.

Интересно, что молекулы-флуорофоры взаимодействуют между собой не совсем так, как другие молекулы. Излучая энергию, они немного нагревают все молекулы растворителя (то же происходит и в случае с проездным билетом или картой), а вот встречая свой флуорофор-акцептор, донор передает ему энергию без излучения, тем не менее акцептор при этом переходит в возбужденное состояние и теперь способен сам излучать свет. Кроме того, и в бесконтактной работе карты, и в переносе энергии между флуорофорами расстояние, на котором происходит взаимодействие, значительно меньше, чем длина волны излучения, которое испускает передатчик (неважно, турникет это или молекула-донор). Главное требование к паре «донор ⎼ акцептор» – перекрывание спектров, то есть донор испускает свет только тех длин волн, которые может поглотить акцептор, но перенос энергии при этом происходит без излучения фотона. Это явление называется FRET (Fluorescens Resonans Energy Transfer – резонансный перенос энергии флуоресценции) (рис. 1).

Рис.1 Физическая природа флуорофора

Резонансный перенос энергии флуоресценции

У этого явления есть особенности, которые сделали его незаменимым инструментом исследования в молекулярной биологии и биофизике. При сближении донора и акцептора перенос энергии происходит неизбежно, этот факт позволяет использовать перенос энергии как датчик сближения двух молекул в пространстве. Для этого достаточно поставить на двух молекулах флуоресцентные метки.

Эта универсальность позволяет использовать данный метод для изучения взаимодействия любых молекул (ДНК, белков, пептидов-регуляторов, факторов роста, гормонов) и, например, клеточных мембран или внутриклеточных структур, так как, подбирая флуорофоры и модифицируя ими молекулы, мы включаем сигнализацию. Появление переноса энергии, которое можно наблюдать как флуоресцентный сигнал в микроскоп, будет равносильно ее срабатыванию. Причем к белкам приделывать хромофор вовсе не обязательно, многие из них уже обладают флуоресцирующими свойствами, многие клетки сами синтезируют флуоресцирующие белки, поэтому их повреждение при исследовании внутри живого организма можно минимизировать или исключить вовсе.

Немного истории
Интересна история открытия флуоресцентных белков. Еще в далеком 1955 году первооткрыватель зеленого флуоресцентного белка Осамо Шимамура, будучи студентом университета Нагойи, начал заниматься биолюминисценцией и пытался понять, почему разлагающиеся моллюски рода Cypridina светятся в темноте. Тогда Осамо еще не был даже аспирантом, но его успехи настолько поразили профессуру, что он получил степень PhD (в нашей классификации ученых степеней – кандидат наук) заочно, и после публикации результатов его пригласили работать в США. Там Шимамура продолжил изучать светящиеся организмы, собирая и перерабатывая до трех тысяч медуз на морском берегу. Первым выделенным из медузы флуоресцирующим белком был экворин. Это белок, который светился вовсе не зеленым, как сами медузы, а синим светом, что обусловлено окислительным присоединением молекулы целентеразина и присутствием в морской воде ионов кальция. Эта экворин-целентеразиновая система до сих пор используется в качестве основных биохимических сенсоров присутствия молекул Ca 2+ в растворе. Улавливаете мысль? Для того чтобы найти молекулу в растворе, достаточно окрасить раствор, и по степени интенсивности свечения можно сосчитать количество молекул.

В 1962 году Шимамура понял, что медуза содержит еще один флуоресцирующий белок и для его свечения необходим только возбуждающий поток света, кислород в обычных концентрациях и, в отличие от своего «первенца» экворина, он не требует никаких дополнительных кофакторов. Этот зеленый флуоресцент, названный GFP, через 50 лет был удостоен Нобелевской премии. В те далекие времена данный феномен было трудно использовать, это были только первые шаги в биотехнологии.

Революция началась с того, что Шимамура после встречи в Колумбийском университете Нью-Йорка с Мартином Шелфи, который изучал знаменитого червячка Caenorhabditis elegans, любимца генетиков, предложил использовать GFP для картирования клеток развивающихся зародышей этого червяка, а также для исследования некоторых внутриклеточных белков. Это стало возможным благодаря бурному росту технологий и технических возможностей в конце 80-х годов прошлого века. Результаты их исследований поразили ученых всего мира: внутри клетки можно было проследить за перемещением отдельных белков в реальном времени, организм от этого практически не страдал. И самое главное, для этого нужен был обычный микроскоп с ультрафиолетовой лампой и светофильтром, пропускающим нужную длину волны. На рисунке 2 мы видим, что активация клеток TNF-a вызывает циркулярное перемещение (цитоплазма ⎼ ядро ⎼ цитоплазма) факторов транскрипции (NFkB, зеленый) и их ингибиторов (IkB, красный). Цифры в углу обозначают время в минутах после стимуляции, а стрелками показана одна и та же клетка.

Рис. 2. Активация клеток TNF-a вызывает циркулярное перемещение «цитоплазма – ядро – цитоплазма» факторов транскрипции (NFkB, зеленый) и их ингибиторов (IkB, красный)

Стоит обратить внимание и на красный цвет на этом рисунке. Выяснилось, что при помощи направленного мутагенеза можно не только усилить свечение белка, но и изменить его цвет. Так получились желтые, красные, синие варианты GFP. Важно и то, что для того, чтобы белки обладали флуоресценцией, химически присоединять к ним флуорофор совершенно не обязательно, можно просто использовать белки, которые и так обладают этим свойством и светятся, подобно медузам и другим морским обитателям. То есть светящийся белок может синтезировать сама клетка, а значит, воздействие на нее извне и повреждение минимально.

Для чего нам это все?

На что мы хотим поставить такую уникальную цветофлуоресцентную сигнализацию? Ответ будет зависеть от каждой уникальной научной задачи: например, пометив флуорофорами фермент и субстрат, на который он воздействует, мы можем следить, когда и при каких условиях (время, рН, температура, концентрация) они взаимодействуют, причем иногда прямо в живом организме и в реальном времени. Разве это не одно из чудес современной науки?

На примере флуоресцирующих митохондрий мы сможем рассмотреть и проанализировать их работу, а в дальнейшем увидеть доставку генетических конструкций – части ДНК в клетку ⎼ и визуализировать это чудо генной инженерии (рис. 3).

Рис. 3. Доставка генетических конструкций в клетки человека

Еще один из важных аспектов использования описанного феномена – это то, что эффективность переноса энергии зависит от расстояния между флуорофорами (вспомним карту и турникет). Если быть точнее, она обратно пропорциональна расстоянию в шестой степени (r-6), а коль это так, то перенос энергии очень удобно использовать для измерения расстояния между молекулами, органеллами, ферментами и их субстратами, белками-антигенами и антителами и другими микроскопическими объектами. Этот метод спектроскопической рулетки с диапазоном измерений в несколько ангстрем позволит определить, например, насколько приблизились друг к другу два белка на поверхности клеточной мембраны, а также любую производную от него величину – силу сцепления клетки с поверхностью, на которой она лежит. Представляете, что это значит для ребенка, рожденного с синдромом Лайелла? Степень сцепления кератиноцитов с базальной мембраной можно будет очень точно определить, и это однозначно позволит оценить степень тяжести заболевания и, соответственно, прогноз.

Еще раз хочу обратить внимание на то, что оптическая микроскопия с ее разрешением и раньше позволяла изучать морфологию клетки, но предел этого разрешения не позволял нам заглянуть вглубь и рассмотреть органеллы и отдельные молекулы. Для этого можно было использовать более жесткое ⎼ например, коротковолновое излучение при электронной микроскопии, но оно не позволяло работать с живыми объектами, а только с фиксированными, мертвыми клетками. И лишь теперь мы можем заглянуть вглубь себя, не нанося при этом вреда своему здоровью. Кроме того, окрасив два белка в разные цвета, возможно проследить все нюансы их взаимодействия и их распределение в клетке или посмотреть, как вибрионы-хищники убивают вибрионов-жертв (рис. 4), оценивая эффективность аутофагии как не совсем нового, но ставшего актуальным методом современной терапии инфекционных и вирусных заболеваний в связи с тем, что мы входим в опасную эру неэффективности антибиотиков.

Рис. 4. Вибрионы-хищники убивают вибрионов-жертв

Рис. 5. Химерные мыши, экспрессирующие RFP (красный флоуресцирующий белок), используются для изучения закономерностей индивидуального развития

Кроме того, некоторые опухоли могут сами синтезировать флуоресцентные белки (рис. 5), а тех, которые не могут, мы с вами можем совершенно безопасно окрасить, а также добавить светлячки-сигналы болезней. Скоро наверняка будет создан гаджет, который будет расположен где-нибудь в нашем теле, а пульт от него будет находиться в руках у нашего доктора. И даже на другом конце континента по изменению цветового сигнала от нашего тела он сможет позвать нас на обследование и лечение.

Впервые опубликовано: Les Nouvelles Esthétiques Украина" №1 (101)/2017