Кліткові технології в лікуванні вітіліго: огляд методик

Володимир Цепколенко, д. м. н., заслужений лікар України, професор кафедри дерматовенерології та косметології Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, генеральний директор Українського інституту пластичної хірургії та косметології «Віртус» (Україна)

Катерина Карпенко, лікар-дерматолог клініки «Віртус» (Україна)

Дмитро Пихтєєв, завідувач відділення клітинної трансплантації клініки «Віртус», завідувач біотехнологічної лабораторії «Смарт Селл» (Україна)

Поширеність цього захворювання у світі коливається залежно від регіону і становить від 0,5 до 8,2%. Його характерною рисою є різко обмежені депігментовані ділянки шкіри, що надають значний негативний вплив на психоемоційний стан пацієнта, а отже, і якість його життя. Саме тому сьогодні надзвичайно актуальним є правильний вибір тактики лікування, що дозволяє досягти максимально лікувального та естетичного результату.

Вступ

Справжню причину деструкції меланоцитів досі не встановлено. Однак можна виділити ряд найбільш обґрунтованих теорій патогенезу вітіліго, серед них :

• аутоімуна;
• нейрогенна;
• біохімічна;
• дисбаланс епідермальних цитокінів;
• генетична.

За останніми даними, у розвитку вітіліго велика роль кератиноцитів: вони більше схильні до апоптозу, а зміни меланоцитарно-кератиноцитарного складу можуть призводити до зменшення вироблення кератиноцитообумовленого фактора росту меланоцитів і, відповідно, загибелі меланоцитів.

Традиційна терапія, як правило, полягає у застосуванні місцевих стероїдів, «Псоралена» та УФ(А). Як показує практика, вузькосмуговий UVB не завжди призводить до задовільного результату: після тривалого та послідовного лікування тільки у половини пацієнтів вдається досягти репігментації шкіри в межах 75% і більше.

Щодо стійких до традиційних методів і не прогресуючих форм вітіліго донедавна найбільш актуальним було застосування методик тканинного графтингу. Сьогодні ж з розвитком клітинних технологій з'явилася можливість застосування клітинного графтингу, для якого використовуються культивовані меланоцити та некультивовані клітинні суспензії меланоцитів та кератиноцитів. На цих методиках і хотілося б зупинитись докладніше.

Лікування вітіліго за допомогою некультивованих меланоцитів

Метод використовується для лікування пацієнтів із сегментарним та фокальним вітіліго. Вперше був застосований Gauthier і Surleve-Bazeille у 1992 році введенням суспензії клітин, отриманої зі шкіри волосистої частини голови, у пухир, утворений шляхом заморожування ділянки шкіри вітіліго. Однак застосування цієї методики було обмежено у зв'язку з можливістю локального охолодження тільки на деяких ділянках тіла, труднощами дозування охолодження, а також небезпекою гіпопігментації при кріопошкодженні периферичних меланоцитів. У 1997 році Olsen і Juhlin використовували шар базальних клітин, збагачених епідермальною суспензією клітинної, і досягали репігментації 85%.

У 2001 році Geel та ін. модифікували дві ці методики. При цьому суспензія клітин за допомогою піпетки розподіляється на поверхні дермабразованої плями вітіліго, покривається стерильною оклюзійною пов'язкою на один тиждень. Через три тижні можливе застосування ПУВА або вузькосмугового UVB. Цей метод потребує спеціального обладнання, хоча порівняно з культивуванням меланоцитів вважається порівняно недорогим та потребує менше часу. Крім того, у 70% пацієнтів через три місяці було досягнуто репігментації близько 55%.

При додаванні меланоцитарного (М2) середовища для культивування суспензія клітинна збагачується, сприяючи відновленню більших дефектів (Olsson і Juhlin, 1998). При додаванні гіалуронової кислоти в клітинну суспензію збільшується її в'язкість, що дозволяє покращити прикріплення клітин до реципієнтних ділянок (van Geel та ін, 2001). Було встановлено, що мінімальна кількість меланоцитів, потрібна для досягнення достатньої репігментації, варіює в межах 210–250⁄мм2 (Tegta та ін., 2006).

Дослідження S. Mulekar (2004) включало трансплантацію некультивованої меланоцитарно-кератиноцитарної клітинної суспензії 50 пацієнтам із сегментарним вітіліго та 17 – з фокальним вітіліго, з наступним 5-річним періодом спостереження. Зразок шкіри був отриманий в результаті shave-біопсії в розмірі 110 від реципієнтної області. Готову клітинну суспензію наносили на дермабразовану депігментовану ділянку шкіри та покривали колагеновою пов'язкою.

У групі сегментарного вітіліго 41 пацієнт (84%) показав відмінну репігментацію, 3 (6%) – хорошу та 5 пацієнтів (10%) – погану репігментацію, яка не була збережена до кінця відповідного періоду спостереження.

У групі фокального вітіліго 11 пацієнтів (73%) показали відмінну репігментацію, 1 (7%) – задовільну, та 3 (20%) – погану репігментацію, яка не збереглася до кінця періоду спостереження.

У дослідженні E. Gan та ін. (2011) було проведено трансплантацію некультивованої меланоцитарно-кератиноцитарної клітинної суспензії (клітинний графтинг) 84 пацієнтам, у 13 з них трансплантація проводилася в ділянках лейкотрихії. З сідничної області під місцевою анестезією узяли ультратонкий трансплантат шкіри розміром 1/5 від ділянки вітіліго. Донорську тканину подрібнили і інкубували в 0,25% розчині трипсину 30 хвилин при температурі 37 °С. Згодом донорська тканина епідермісу була механічно відокремлена від дерми, клітинна суспензія нейтралізована соєвим інгібітором трипсину та центрифугована. Осад отриманих клітин ресуспендували у 0,5–1 мл фосфатно-буферного фізіологічного розчину. Після накладання анестезуючого крему під оклюзію на ділянки вітіліго (експозиція – 1 година) було проведено абляцію СО2-лазером. Після цього аблірована поверхня була покрита суспензією клітини з накладенням стерильної колагенової пов'язки і закріплена пластиром на строк до одного тижня.

У 12 пацієнтів (92%) спостерігалася погана репігментація лейкотрихії через три місяці після трансплантації. Через шість місяців задовільна репігментація була досягнута у восьми пацієнтів (67%). Через 9–12 місяців спостереження у 91% пацієнтів (10 із 11) було досягнуто репігментації, якість якої оцінювалася від «добре» до «відмінно».

Таким чином, за допомогою некультивованого клітинного графтингу може бути досягнута репігметація при лейкотрихії (від хорошої до відмінної), що усуває необхідність трансплантації волосся. Ця робота представляє особливий інтерес через труднощі досягнення репігментації у пацієнтів з вітіліго на ділянках лейкотрихії, що пов'язано зі мізерною кількістю меланоцитів поза устами волосяних фолікулів.

Механізм репігментації лейкотрихії при некультивованому клітинному графтингу вивчений поки недостатньо, проте імовірно може бути пов'язаний з ретроградною міграцією пересаджених меланоцитів або епідермальних стовбурових клітин у волосяні фолікули та/або продукцією ними цитокінів, які стимулюють меланогенез. Цей механізм може пояснювати більш тривалий час, необхідний репігментацію ділянки лейкотрихії, порівняно з епідермальною репігментацією.

Лікування вітіліго за допомогою культивованих меланоцитів

Дана методика була описана Lerner та ін. (1987), які досягли успішної репігментації шляхом введення культивованих меланоцитів пацієнтам з пієбалдизмом. Надалі були опубліковані інші підходи до трансплантації меланоцитів у різних умовах культивування, у тому числі і при використанні гіалуронових матриць. У кількох роботах була показана успішність застосування штучної гіалуронової матриці для зростання кератиноцитів та меланоцитів.

Культивовані меланоцити можуть бути внесені у вигляді чистої суспензії клітинної або сокультивуватися з кератиноцитами. Останній варіант, можливо, є більш відповідним у зв'язку з тим, що кератиноцити регулюють зростання та диференціацію меланоцитів, виділяючи велику кількість цитокінів. Меланоцити зберігають свої фізіологічні особливості при їх спільному культивуванні з кератиноцитами, які також можуть бути виготовлені у великій кількості.

Трансплантація змішаної культури клітин використовують протягом 20 років. При цьому достовірної кореляції терапії зі збільшенням ризику виникнення карциноми або меланоми шкіри виявлено не було. Донорська ділянка може бути отримана шляхом біопсії або утворення міхура. Реципієнтна ділянка може бути підготовлена дермабразією, Er: YAG- або CO2-лазером.

У дослідженні, яке проводили автори статті, брали участь 32 пацієнти, хворих на вітіліго, яким була призначена терапія культивованими меланоцитами. В результаті проведеного лікування репігментація кінцівок та періоральних ділянок склала 8%, а на інших ділянках – 88–96% (Guerra та ін., 2000); в іншому дослідженні 18 із 21 пацієнтів отримали 90% репігментації (Guerra та ін., 2003).

У дослідженні Chen та ін. (2004) при пересадці культивованих меланоцитів у 84% зі 120 пацієнтів зі стійким локалізованим вітіліго отримали від 90 до 100% репігментації, серед пацієнтів зі стійким генералізованим вітіліго відсоток повної репігментації склав 54%, з активним генералізованим вітіліго спостерігалася значна репігментація.

У дослідженні Kyoichi Matsuzaki та Norio Kumagai (2013) було проведено трансплантацію культивованих меланоцитів 27 пацієнтам зі стабільним вітіліго, стійким до традиційної терапії. У дослідженні брало участь 20 пацієнтів із сегментарним вітіліго та семеро пацієнтів із генералізованим вітіліго, контроль проводився протягом року після трансплантації.

Кератиноцити були отримані з первинної культури або першого пасажу. Перед трансплантацією область вітіліго була деепітелізована абразивним способом, після – нанесені культивовані клітини та накриті вологою пов'язкою. Після повної епітелізації реципієнтну ділянку піддавали УФ-опромінення.

У групі з сегментарним вітіліго у 12 з 20 пацієнтів спостерігався хороший терапевтичний ефект (90% і більше репігментації) вже після першої пересадки, а після повторної їх кількість збільшилася до 14. У решти шести пацієнтів було отримано задовільні результати (50–90% репігментації) . У пацієнтів з генералізованим вітіліго хороших результатів досягнуто не було, незважаючи на неодноразове використання хірургічних методів (три пацієнти – задовільні результати, чотири – без змін).

Використання різних біотехнологічних прийомів дозволяє проводити дуже гнучку терапію аналізованого захворювання. Особливий інтерес становлять методи кріоконсервування отриманих клітинних суспензій.

Меланоцитарні суспензії, що зберігалися у замороженому стані протягом 6–12 місяців, були повторно культивовані після розморожування та пересаджені чотирма пацієнтами; Настала успішна репігментація вогнищ вітіліго дозволяє зробити висновок про великий потенціал кріоконсервованих клітин для успішного лікування вітіліго (Olsson та ін, 1994).

Метод культивування меланоцитів потребує спеціалізованого обладнання, створення аутологічних дорогих культур, наявності висококваліфікованих спеціалістів та займає значний час.

Біологічний процес культивування кератиноцито-меланоцитарної суміші складається із забору ділянки шкіри (якщо це необхідно, то попередньо індукованої пігментації). Потім біоптати прямують до біотехнологічної лабораторії. Там вони проходять ферментативну обробку та відокремлення дерми від епідермісу. Епідермальний шар використовують у роботі після виділення кератиноцитарно-меланоцитарної суспензії, яка зазвичай культивується на середовищі DMEM, іноді суміші середовищ DMEM-F 12, в різних співвідношеннях.

Істотною перевагою цього методу є можливість лікування великих ділянок вітіліго за допомогою невеликої донорської ділянки. Також трансплантація культивованих кератиноцитів виявилася ефективнішою при лікуванні сегментарного вітіліго, а не генералізованого.

В даний час метод культивування меланоцитів успішно використовується в терапії стійких форм вітіліго в ІПХ «Віртус» (Одеса). Багато в чому це стало можливим завдяки тісній співпраці з єдиною на півдні України біотехнологічною лабораторією, оснащеною відповідно до стандартів GMP. Висококваліфіковані фахівці біотехнологічної лабораторії ретельно контролюють кожен етап підготовки клітинного матеріалу та гарантують його якість та безпеку.

Загальні принципи терапії вітіліго з використанням клітинних технологій

Вибір способу. Будь-яка правильно виконана техніка із наведених вище веде до позитивних результатів. Важливим принципом є використання найменш інвазивного методу для одержання кращих результатів, також важливо зберегти цілісність донорських ділянок.

Відбір пацієнтів. При проведенні репігментації шкіри за допомогою клітинних технологій слід брати до уваги низку факторів, таких як:

• стійка форма вітіліго: ступінь стійкості вітіліго немає спеціального визначення, проте що довше період спостереження, тим стійкішим вважається форма захворювання. Сегментарне (одностороннє) вітіліго є найбільш стійкою формою, яка добре реагує на клітинну терапію;
• відповідність результатів очікуванням пацієнтів: зовнішній вигляд шкіри після репігментації не завжди збігається з видом здорової шкіри, крім того, результати відрізняються у різних пацієнтів. Можлива невелика гіперпігментація, проте ступінь її незначна, порівняно з отриманими позитивними змінами;
• ступінь депігментації: найкращі результати спостерігаються у пацієнтів ІІІ–VI фототипів за Фітцпатриком на повністю депігментованих ділянках, гіпопігментовані ділянки репігментуються значно гірше;
• локалізація вітіліго на відкритих ділянках: у терапії вітіліго з такою локалізацією зацікавлена більшість пацієнтів. Хоча тильна поверхня кистей і пальців – ділянки, що найбільш важко піддаються, проте при чітко визначеній стійкій формі можна досягти успішної репігментації і на цих ділянках;
• етапність лікування: у ряді випадків для досягнення найкращого результату може бути проведено повторне введення клітинної суспензії, але не раніше ніж через три місяці після першого введення;
• психологічні аспекти: деякі пацієнти висувають підвищені вимоги щодо мінімальної чи помірної депігментації, пацієнти повинні бути уважно обстежені для визначення реальної необхідності хірургічного лікування;
• фотореєстрація: фотодокументація завжди рекомендується для оцінки якості та процентної величини репігментації, а також можливих побічних ефектів;
• вибір методу та донорські ділянки: рекомендується використовувати мінімально неінвазивні методи. Донорські ділянки повинні бути максимально закриті, можливе використання зони сідниць, внутрішньої верхньої частини стегна або передпліччя.

Протипоказання. Пацієнти з гіпертрофічними та келоїдними рубцями, гіперпігментацією на місцях опіків або травм повинні бути уважно обстежені, щоб уникнути подібних ускладнень при проведенні лікування із застосуванням клітинних технологій.

Побічні ефекти:

• інфікування: трапляється рідко, проте необхідно пам'ятати про дотримання правил асептики та антисептики для профілактики бактеріальних інфекцій; при загостренні герпетичної інфекції застосовуються антивірусні препарати системно;
• післязапальна гіперпігментація: в основному носить тимчасовий характер у більшості пацієнтів, особливо у людей зі шкірними фототипами від IV до VI. Протизапальні цитокіни, активовані у процесі хірургічних маніпуляцій, можуть відігравати важливу роль у патогенезі гіперпігментації. Постійна гіперпігментація на травмованих ділянках шкіри може бути протипоказанням клітинної терапії.

Висновки

Застосування клітинних технологій у дерматології відкрило нові можливості у пошуку ефективних методик лікування вітіліго. На сьогоднішній день багато пацієнтів отримують традиційну терапію вітіліго, проте часткова або неповна репігментація зустрічається у досить великої кількості пацієнтів. Різні види терапії успішно використовуються для лікування вітіліго в області обличчя та шиї, на тулубі та проксимальних частинах кінцівок – із задовільними результатами, на акральних частинах кінцівок ефект слабкий або взагалі відсутній.

При широкому генералізованому двосторонньому вітіліго найкращі результати досягаються при терапії NB UVB і PUVA, тоді як у разі локалізованого вітіліго найбільшу ефективність показують топічні кортикостероїди та інгібітори кальциневрину.

Сучасний комплексний підхід до лікування стійких форм вітіліго, що застосовується в ІПХ «Віртус», включає комбінацію вузькосмугової фототерапії з максимумом емісії на 311 нм, введення культивованої меланоцитарно-кератиноцитарної суспензії, а також зовнішню терапію та інгібітори кальцію. захворювань.

При терапії сегментарного вітіліго із застосуванням клітинних методів у 60–100% пацієнтів рівень репігментації становить 70–100%, а при терапії стійкого генералізованого вітіліго подібний відсоток репігментації спостерігається лише у 50% пацієнтів. Прогрес подальших досліджень нових та ефективних методів терапії заснований на вивченні патогенезу вітіліго. Важливе значення визначення найбільш ефективної терапії вітіліго має стандартизація методів оцінки як щодо ефективності, і якості життя пацієнта.

Вперше опубліковано: Les Nouvelles Esthetiques Україна, №5 (87), 2014