Флуоресцентні білки: навіщо світять молекули

Принцип дії

Кожен житель мегаполісу чудово знає, як користуватися безконтактними банківськими картками чи картками для оплати проїзду та аналогічними перепустками до школи чи на роботу. Простіше нікуди: підніс картку до турнікету, спалахнув зелений вогник – проходь.

Принцип дії такого пристрою зрозумілий навіть школяреві: у «голові» турнікета знаходиться передавач, а в картці – маленький пристрій, що приймає. Якщо цей пристрій піднести до передавача турнікета на певну відстань (у випадку з метрополітеном кілька сантиметрів), він приймає випромінювання передавача. У їхньому контурі взаємодії виникає електричний струм, і простенька електроніка обох пристроїв починає виконувати свою роботу - звіряє місяць і число, кількість поїздок. Те саме відбувається і з банківською картою, піднесеною до зчитувального пристрою, тільки масив даних дещо збільшується. Тобто квиток або карта отримує енергію від зчитувального пристрою, а потім її ж і випускає, причому енергія квитка або карти за законом збереження енергії завжди буде меншою за ту, яка дісталася їм від зчитувального пристрою, адже частина її пішла на обробку інформації і одночасно нагріла своє оточення (у прямому значенні). Зрозуміло, що це взаємодія відбувається у тому разі, якщо передавач і приймач перебувають у певному, досить близької відстані.

Але нас з вами має хвилювати інше питання: наскільки маленькими можна створити ці два пристрої? Сьогодні відповідь така: розміром з молекулу і навіть менше, але в цьому випадку молекули-передавачі та зчитувальні пристрої повинні бути флуорофорами: одна повинна вміти випромінювати світло (донор), а друга – поглинати його (акцептор). Причому таке перенесення енергії можливе не для будь-яких, а для певних пар донорів і акцепторів (ви ж не пройдете в метро за своїм робочим пропуском).

Зрозуміло, що у разі дуже маленьких передавачів взаємодія між ними відбувається на відстанях, рівних міжмолекулярній взаємодії – кільком десяткам ангстрем.

Цікаво, що молекули-флуорофори взаємодіють між собою не зовсім так, як інші молекули. Випромінюючи енергію, вони трохи нагрівають всі молекули розчинника (те саме відбувається і у випадку з проїзним квитком або картою), а ось зустрічаючи свій флуорофор-акцептор, донор передає йому енергію без випромінювання, проте акцептор при цьому переходить у збуджений стан і тепер здатний сам випромінювати світло. Крім того, і в безконтактній роботі карти, і в перенесенні енергії між флуорофорами відстань, на якій відбувається взаємодія, значно менша, ніж довжина хвилі випромінювання, яке випромінює передавач (неважливо, це турнікет або молекула-донор). Головна вимога до пари «донор ⎼ акцептор» – перекриття спектрів, тобто донор випромінює світло лише тих довжин хвиль, які може поглинути акцептор, але перенесення енергії при цьому відбувається без випромінювання фотона. Це називається FRET (Fluorescens Resonans Energy Transfer – резонансне перенесення енергії флуоресценції) (рис. 1).

Рис.1 Фізична природа флуорофору

Резонансне перенесення енергії флуоресценції

Це явище має особливості, які зробили його незамінним інструментом дослідження в молекулярній біології та біофізиці. При зближенні донора та акцептора перенесення енергії відбувається неминуче, цей факт дозволяє використовувати перенесення енергії як датчик зближення двох молекул у просторі. Для цього достатньо поставити на двох молекул флуоресцентні мітки.

Ця універсальність дозволяє використовувати даний метод для вивчення взаємодії будь-яких молекул (ДНК, білків, пептидів-регуляторів, факторів росту, гормонів) і, наприклад, клітинних мембран або внутрішньоклітинних структур, оскільки підбираючи флуорофори і модифікуючи ними молекули, ми включаємо сигналізацію. Поява перенесення енергії, яку можна спостерігати як флуоресцентний сигнал у мікроскоп, буде рівносильною її спрацьовування. Причому до білків прилаштовувати хромофор зовсім не обов'язково, багато з них вже мають флуоресцентні властивості, багато клітин самі синтезують флуоресцирующие білки, тому їх пошкодження при дослідженні всередині живого організму можна мінімізувати або виключити зовсім.

Трохи історії
Цікавою є історія відкриття флуоресцентних білків. Ще в далекому 1955 році першовідкривач зеленого флуоресцентного білка Осамо Шимамура, будучи студентом університету Нагої, почав займатися біолюмінісценцією і намагався зрозуміти, чому молюски роду Cypridina, що розкладаються, світяться в темряві. Тоді Осамо ще не був навіть аспірантом, але його успіхи настільки вразили професуру, що він отримав ступінь PhD (у нашій класифікації вчених ступенів – кандидат наук) заочно, і після публікації результатів його запросили працювати до США. Там Шимамура продовжив вивчати організми, що світяться, збираючи і переробляючи до трьох тисяч медуз на морському березі. Першим виділеним з медузи флуоресцентним білком був екворин. Це білок, що світився зовсім не зеленим, як самі медузи, а синім світлом, що обумовлено окислювальним приєднанням молекули целентеразину та присутністю в морській воді іонів кальцію. Ця екворин-целентеразінова система досі використовується як основні біохімічні сенсори присутності молекул Ca 2+ в розчині. Уловлюєте думку? Щоб знайти молекулу в розчині, досить пофарбувати розчин, і за рівнем інтенсивності світіння можна порахувати кількість молекул.

У 1962 році Шимамура зрозумів, що медуза містить ще один флуоресцентний білок і для його свічення необхідний лише збуджуючий потік світла, кисень у звичайних концентраціях і, на відміну від свого «первістка» екворину, він не вимагає додаткових кофакторів. Цей зелений флуоресцент, названий GFP, за 50 років був удостоєний Нобелівської премії. У ті далекі часи цей феномен було важко використати, це були лише перші кроки у біотехнології.

Революція почалася з того, що Шимамура після зустрічі в Колумбійському університеті Нью-Йорка з Мартіном Шелфі, який вивчав знаменитого черв'ячка Caenorhabditis elegans, улюбленця генетиків, запропонував використовувати GFP для картування клітин зародків цього черв'яка, що розвиваються, а також для дослідження деяких внутрішньоклітинних білків. Це стало можливим завдяки бурхливому зростанню технологій та технічних можливостей наприкінці 80-х років минулого століття. Результати їх досліджень вразили вчених усього світу: усередині клітини можна було простежити за переміщенням окремих білків у реальному часі, організм від цього практично не страждав. І найголовніше, для цього потрібен був звичайний мікроскоп із ультрафіолетовою лампою та світлофільтром, що пропускає потрібну довжину хвилі. На малюнку 2 ми бачимо, що активація клітин TNF-a викликає циркулярне переміщення (цитоплазма - ядро - цитоплазма) факторів транскрипції (NFkB, зелений) та їх інгібіторів (IkB, червоний). Цифри в кутку позначають час у хвилинах після стимуляції, а стрілками показана та сама клітина.

Мал. 2. Активація клітин TNF-a викликає циркулярне переміщення «цитоплазма – ядро – цитоплазма» факторів транскрипції (NFkB, зелений) та їх інгібіторів (IkB, червоний)

Варто звернути увагу на червоний колір на цьому малюнку. З'ясувалося, що за допомогою спрямованого мутагенезу можна не лише посилити свічення білка, а й змінити його колір. Так вийшло жовте, червоне, синє варіанти GFP. Важливо й те, що для того, щоб білки мали флуоресценцію, хімічно приєднувати до них флуорофор зовсім не обов'язково, можна просто використовувати білки, які і так мають цю властивість і світяться, подібно до медуз та інших морських мешканців. Тобто білок, що світиться, може синтезувати сама клітина, а значить, вплив на неї ззовні і пошкодження мінімально.

Навіщо нам це все?

На що ми хочемо поставити таку унікальну кольорофлуоресцентну сигналізацію? Відповідь залежатиме від кожного унікального наукового завдання: наприклад, помітивши флуорофорами фермент і субстрат, на який він впливає, ми можемо стежити, коли і за яких умов (час, рН, температура, концентрація) вони взаємодіють, причому іноді прямо в живому організмі у реальному часі. Хіба це не одне із чудес сучасної науки?

На прикладі флуоресціюючих мітохондрій ми зможемо розглянути та проаналізувати їхню роботу, а надалі побачити доставку генетичних конструкцій – частини ДНК у клітину ⎼ та візуалізувати це диво генної інженерії (рис. 3).

Мал. 3. Доставка генетичних конструкцій у клітини людини

Ще один із важливих аспектів використання описаного феномену – це те, що ефективність перенесення енергії залежить від відстані між флуорофорами (згадаймо карту та турнікет). Якщо бути точніше, вона обернено пропорційна відстані в шостій мірі (r-6), а якщо це так, то перенесення енергії дуже зручно використовувати для вимірювання відстані між молекулами, органелами, ферментами та їх субстратами, білками-антигенами та антитілами та іншими мікроскопічними об'єктами . Цей метод спектроскопічної рулетки з діапазоном вимірювань у кілька ангстрем дозволить визначити, наприклад, наскільки наблизилися один до одного два білки на поверхні клітинної мембрани, а також будь-яку похідну від нього величину - силу зчеплення клітини з поверхнею, на якій вона лежить. Уявляєте, що це означає для дитини, народженої з синдромом Лайєлла? Ступінь зчеплення кератиноцитів з базальною мембраною можна буде точно визначити, і це однозначно дозволить оцінити ступінь тяжкості захворювання і, відповідно, прогноз.

Ще раз хочу звернути увагу на те, що оптична мікроскопія з її роздільною здатністю і раніше дозволяла вивчати морфологію клітини, але межа цього дозволу не дозволяла нам заглянути вглиб і розглянути органели та окремі молекули. Для цього можна було використовувати більш жорстке, наприклад, короткохвильове випромінювання при електронній мікроскопії, але воно не дозволяло працювати з живими об'єктами, а тільки з фіксованими, мертвими клітинами. І лише тепер ми можемо зазирнути углиб себе, не завдаючи при цьому шкоди своєму здоров'ю. Крім того, пофарбувавши два білки в різні кольори, можливо простежити всі нюанси їх взаємодії та їх розподіл у клітині або подивитися, як вібріони-хижаки вбивають вібріонів-жертв (рис. 4), оцінюючи ефективність аутофагії як не зовсім нового, але актуального методу. сучасної терапії інфекційних та вірусних захворювань у зв'язку з тим, що ми входимо у небезпечну еру неефективності антибіотиків.

Мал. 4. Вібріони-хижаки вбивають вібріонів-жертв

Мал. 5. Химерні миші, що експресують RFP (червоний флоуресцентний білок), використовуються для вивчення закономірностей індивідуального розвитку

Крім того, деякі пухлини можуть самі синтезувати флуоресцентні білки (мал. 5), а тих, які не можуть, ми з вами можемо безпечно забарвити, а також додати світлячки-сигнали хвороб. Скоро, напевно, буде створено гаджет, який буде розташований десь у нашому тілі, а пульт від нього перебуватиме в руках нашого лікаря. І навіть на іншому кінці континенту щодо зміни колірного сигналу від нашого тіла він зможе покликати нас на обстеження та лікування.

Вперше опубліковано: Les Nouvelles Esthétiques Україна" №1 (101)/2017